PCR प्रतिक्रियाहरूमा हस्तक्षेप कारकहरू

PCR प्रतिक्रियाको क्रममा, केही हस्तक्षेपकारी कारकहरू प्रायः सामना गरिन्छन्।
PCR को धेरै उच्च संवेदनशीलताको कारण, प्रदूषणलाई PCR नतिजाहरूलाई असर गर्ने सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कारकहरू मध्ये एक मानिन्छ र यसले गलत सकारात्मक नतिजाहरू उत्पादन गर्न सक्छ।
गलत-नकारात्मक नतिजा निम्त्याउने विभिन्न स्रोतहरू पनि उत्तिकै महत्त्वपूर्ण छन्। यदि PCR मिश्रणको एक वा बढी आवश्यक भागहरू वा प्रवर्धन प्रतिक्रिया आफैंमा रोक लगाइयो वा हस्तक्षेप गरियो भने, निदान परीक्षणमा बाधा पुग्न सक्छ। यसले दक्षता कम गर्न सक्छ र गलत नकारात्मक नतिजा पनि निम्त्याउन सक्छ।
निषेधको अतिरिक्त, नमूना तयारी गर्नु अघि ढुवानी र/वा भण्डारण अवस्थाहरूको कारणले लक्षित न्यूक्लिक एसिडको अखण्डताको क्षति हुन सक्छ। विशेष गरी, उच्च तापक्रम वा अपर्याप्त भण्डारणले कोषहरू र न्यूक्लिक एसिडहरूको क्षति निम्त्याउन सक्छ। कोष र तन्तु स्थिरीकरण र प्याराफिन इम्बेडिङ डीएनए विखंडन र निरन्तर समस्याको प्रख्यात कारणहरू हुन् (चित्र १ र २ हेर्नुहोस्)। यी अवस्थाहरूमा, इष्टतम अलगाव र शुद्धीकरणले पनि मद्दत गर्दैन।

चित्र १ | डीएनए अखण्डतामा स्थिरीकरणको प्रभाव
अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसले शव परीक्षणको प्याराफिन खण्डहरूबाट अलग गरिएको डीएनएको गुणस्तरमा उल्लेखनीय भिन्नता रहेको देखाएको छ। फिक्सेसन विधिको आधारमा अर्कहरूमा फरक औसत खण्ड लम्बाइको डीएनए उपस्थित थियो। नेटिभ फ्रोजन नमूनाहरू र बफर गरिएको तटस्थ फर्मालिनमा फिक्स गर्दा मात्र डीएनए संरक्षित गरिएको थियो। कडा अम्लीय बोइन फिक्सेटिभ वा बफर नगरिएको, फर्मिक एसिड युक्त फर्मालिनको प्रयोगले डीएनएको उल्लेखनीय क्षति निम्त्यायो। बाँकी अंश अत्यधिक खण्डित छ।
बायाँतिर, टुक्राहरूको लम्बाइ किलोबेस जोडी (kbp) मा व्यक्त गरिएको छ।

चित्र २ | न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यहरूको अखण्डताको हानि
(क) दुबै स्ट्र्यान्डहरूमा ३′-५′ अन्तरले लक्षित DNA मा ब्रेक निम्त्याउनेछ। DNA को संश्लेषण अझै पनि सानो टुक्रामा हुनेछ। यद्यपि, यदि DNA टुक्रामा प्राइमर एनिलिङ साइट हराइरहेको छ भने, केवल रेखीय प्रवर्धन हुन्छ। सबैभन्दा अनुकूल अवस्थामा, टुक्राहरू एकअर्कालाई पुन: संतृप्त गर्न सक्छन्, तर उपज सानो र पत्ता लगाउने स्तरभन्दा कम हुनेछ।
(ख) मुख्यतया डिप्युरिनेसन र थाइमिडाइन डाइमर गठनको कारणले आधारहरूको क्षतिले H-बन्डहरूको संख्यामा कमी र Tm मा कमी ल्याउँछ। लामो तापक्रम चरणको समयमा, प्राइमरहरू म्याट्रिक्स DNA बाट पग्लिनेछन् र कम कडा परिस्थितिहरूमा पनि एनिल हुनेछैनन्।
(ग) छेउछाउका थाइमिन आधारहरूले TT डाइमर बनाउँछन्।
आणविक निदानमा प्रायः हुने अर्को सामान्य समस्या भनेको फिनोल-क्लोरोफर्म निकासीको तुलनामा लक्षित न्यूक्लिक एसिडको कम-इष्टतम रिलीज हो। चरम अवस्थामा, यो गलत नकारात्मकसँग सम्बन्धित हुन सक्छ। कोशिकाको मलबेको उमालेर लिसिस वा इन्जाइमेटिक पाचन गरेर धेरै समय बचत गर्न सकिन्छ, तर यो विधिले प्रायः अपर्याप्त न्यूक्लिक एसिड रिलीजको कारणले कम PCR संवेदनशीलता निम्त्याउँछ।

प्रवर्धनको समयमा पोलिमरेज गतिविधिको अवरोध

सामान्यतया, निषेधलाई सबओप्टिमल पीसीआर नतिजाहरू निम्त्याउने सबै कारकहरू वर्णन गर्न कन्टेनर अवधारणाको रूपमा प्रयोग गरिन्छ। कडा रूपमा जैव रासायनिक अर्थमा, निषेध इन्जाइमको गतिविधिमा सीमित छ, अर्थात्, यसले डीएनए पोलिमरेज वा यसको सह-कारकको सक्रिय साइट (जस्तै, ट्याक डीएनए पोलिमरेजको लागि Mg2+) सँग अन्तरक्रिया मार्फत सब्सट्रेट-उत्पादन रूपान्तरणलाई कम गर्छ वा रोक्छ।
नमूनामा भएका कम्पोनेन्टहरू वा अभिकर्मकहरू भएका विभिन्न बफरहरू र अर्कहरूले इन्जाइमलाई प्रत्यक्ष रूपमा रोक्न सक्छन् वा यसको सहकारकहरू (जस्तै EDTA) लाई फसाउन सक्छन्, जसले गर्दा पोलिमरेज निष्क्रिय हुन्छ र फलस्वरूप घटेको वा गलत नकारात्मक PCR नतिजाहरू निम्त्याउँछ।
यद्यपि, प्रतिक्रिया घटकहरू र लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक एसिडहरू बीचको धेरै अन्तरक्रियाहरूलाई 'PCR अवरोधकहरू' को रूपमा पनि तोकिएको छ। एक पटक अलगाव द्वारा कोशिकाको अखण्डता बाधित भएपछि र न्यूक्लिक एसिड जारी भएपछि, नमूना र यसको वरपरको घोल र ठोस चरण बीच अन्तरक्रिया हुन सक्छ। उदाहरणका लागि, 'स्क्याभेन्जरहरू' ले गैर-सह-संयोजक अन्तरक्रियाहरू मार्फत एकल- वा दोहोरो-असन्तुष्ट DNA लाई बाँध्न सक्छन् र अन्ततः PCR प्रतिक्रिया पोतमा पुग्ने लक्ष्यहरूको संख्या घटाएर अलगाव र शुद्धीकरणमा हस्तक्षेप गर्न सक्छन्।
सामान्यतया, PCR अवरोधकहरू अधिकांश शरीरको तरल पदार्थ र क्लिनिकल निदान परीक्षणहरूको लागि प्रयोग हुने अभिकर्मकहरू (पिसाबमा युरिया, रगतमा हेमोग्लोबिन र हेपरिन), आहार पूरकहरू (जैविक घटकहरू, ग्लाइकोजेन, बोसो, Ca2+ आयनहरू) र वातावरणमा रहेका घटकहरू (फिनोलहरू, भारी धातुहरू) मा उपस्थित हुन्छन्।

अधिक प्रचलित PCR अवरोधकहरू ब्याक्टेरिया र युकेरियोटिक कोषहरू, गैर-लक्ष्य DNA, तन्तु म्याट्रिक्सको DNA-बाइन्डिङ म्याक्रोमोलेक्युलहरू र पन्जा र प्लास्टिक जस्ता प्रयोगशाला उपकरणहरूमा पाउन सकिन्छ। निकासीको समयमा वा पछि न्यूक्लिक एसिडको शुद्धीकरण PCR अवरोधकहरू हटाउनको लागि रुचाइएको विधि हो।
आज, विभिन्न स्वचालित निकासी उपकरणहरूले धेरै म्यानुअल प्रोटोकलहरू प्रतिस्थापन गर्न सक्छन्, तर लक्ष्यहरूको १००% पुन: प्राप्ति र/वा शुद्धीकरण कहिल्यै प्राप्त भएको छैन। सम्भावित अवरोधकहरू अझै पनि शुद्ध न्यूक्लिक एसिडहरूमा उपस्थित हुन सक्छन् वा पहिले नै प्रभाव पारिसकेका हुन सक्छन्। अवरोधकहरूको प्रभाव कम गर्न विभिन्न रणनीतिहरू अवस्थित छन्। उपयुक्त पोलिमरेजको छनोटले अवरोधक गतिविधिमा महत्त्वपूर्ण प्रभाव पार्न सक्छ। PCR अवरोध कम गर्ने अन्य प्रमाणित विधिहरू पोलिमरेज सांद्रता बढाउनु वा BSA जस्ता additives लागू गर्नु हो।
आन्तरिक प्रक्रिया गुणस्तर नियन्त्रण (IPC) को प्रयोगद्वारा PCR प्रतिक्रियाहरूको अवरोध प्रदर्शन गर्न सकिन्छ।
न्यूक्लिक एसिड आइसोलेटबाट इथेनॉल, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, आइसोप्रोपानोल र फिनोल जस्ता निकासी किटमा रहेका सबै अभिकर्मकहरू र अन्य समाधानहरूलाई राम्ररी धुने चरणद्वारा हटाउन सावधानी अपनाउनु पर्छ। तिनीहरूको एकाग्रतामा निर्भर गर्दै, तिनीहरूले PCR सक्रिय वा अवरोध गर्न सक्छन्।