PCR प्रतिक्रियाहरूमा हस्तक्षेप कारकहरू

PCR प्रतिक्रियाको समयमा, केहि हस्तक्षेपकारी कारकहरू प्रायः सामना हुन्छन्।
PCR को धेरै उच्च संवेदनशीलताको कारण, PCR परिणामहरूलाई असर गर्ने सबैभन्दा महत्त्वपूर्ण कारक मध्ये एक प्रदूषण मानिन्छ र गलत सकारात्मक परिणामहरू उत्पादन गर्न सक्छ।
समान रूपमा महत्वपूर्ण विभिन्न स्रोतहरू हुन् जसले गलत-नकारात्मक परिणामहरू निम्त्याउँछ। यदि PCR मिश्रणको एक वा बढी अत्यावश्यक भागहरू वा एम्प्लीफिकेशन प्रतिक्रिया आफैंलाई निषेधित वा हस्तक्षेप गरिएको छ भने, निदान परख बाधा हुन सक्छ। यसले कम दक्षता र गलत नकारात्मक नतिजाहरू निम्त्याउन सक्छ।
निषेधको अतिरिक्त, नमूना तयारी गर्नु अघि ढुवानी र/वा भण्डारण अवस्थाहरूको कारणले लक्ष्य न्यूक्लिक एसिड अखण्डताको हानि हुन सक्छ। विशेष गरी, उच्च तापक्रम वा अपर्याप्त भण्डारणले कोशिकाहरू र न्यूक्लिक एसिडहरूलाई क्षति पुर्‍याउन सक्छ। सेल र टिस्यु फिक्सेसन र प्याराफिन इम्बेडिङ DNA खण्डीकरण र निरन्तर समस्याको ज्ञात कारणहरू हुन् (चित्र 1 र 2 हेर्नुहोस्)। यी अवस्थाहरूमा, इष्टतम अलगाव र शुद्धिकरणले पनि मद्दत गर्दैन।

चित्र १ | डीएनए अखण्डतामा स्थिरताको प्रभाव
Agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसले देखायो कि शव परीक्षणको प्याराफिन खण्डहरूबाट अलग गरिएको डीएनएको गुणस्तरमा धेरै भिन्नता छ। विभिन्न औसत टुक्रा लम्बाइको DNA फिक्सेशन विधिको आधारमा अर्कहरूमा उपस्थित थियो। नेटिभ फ्रोजन नमूनाहरूमा र बफर गरिएको तटस्थ फर्मालिनमा फिक्स गर्दा मात्र डीएनए सुरक्षित गरिएको थियो। कडा अम्लीय बोइन फिक्सेटिभ वा अनबफर गरिएको, फॉर्मिक एसिड युक्त फर्मालिनको प्रयोगले डीएनएको महत्त्वपूर्ण हानि निम्त्यायो। बाँकी अंश अत्यधिक खण्डित छ।
बाँयामा, टुक्राहरूको लम्बाइ किलोबेस जोडी (kbp) मा व्यक्त गरिएको छ।

चित्र २ | न्यूक्लिक एसिड लक्ष्यहरूको अखण्डताको हानि
(a) दुबै स्ट्र्यान्डहरूमा 3′-5′ अन्तरले लक्ष्य DNA मा ब्रेक निम्त्याउँछ। DNA को संश्लेषण अझै पनि सानो टुक्रा मा हुनेछ। यद्यपि, यदि DNA टुक्रामा प्राइमर एनिलिङ साइट हराइरहेको छ भने, केवल रेखीय प्रवर्धन हुन्छ। सबैभन्दा अनुकूल अवस्थामा, टुक्राहरू एकअर्कालाई पुन: प्राप्त गर्न सक्छन्, तर उत्पादनहरू सानो र पत्ता लगाउने स्तर भन्दा कम हुनेछन्।
(b) आधारहरूको हानि, मुख्यतया depurination र thymidine dimer गठनको कारणले, H-bonds को संख्यामा कमी र Tm मा कमी निम्त्याउँछ। लामो वार्मिङ चरणको दौडान, प्राइमरहरू म्याट्रिक्स DNA बाट पग्लिनेछन् र कम कडा परिस्थितिहरूमा पनि एनाल गर्दैनन्।
(c) छेउछाउको थाइमाइन आधारहरूले TT डाइमर बनाउँछ।
अर्को सामान्य समस्या जुन प्राय: आणविक निदानमा देखा पर्दछ, फिनोल-क्लोरोफर्म निकासीको तुलनामा लक्ष्य न्यूक्लिक एसिडको कम-इष्टतम रिलीज हो। चरम अवस्थामा, यो गलत नकारात्मक संग सम्बन्धित हुन सक्छ। उबलते लिसिस वा सेल मलबेको इन्जाइमेटिक पाचन द्वारा धेरै समय बचाउन सकिन्छ, तर यो विधि प्रायः न्यूक्लिक एसिड अपर्याप्त रिलिजको कारण कम PCR संवेदनशीलतामा परिणाम दिन्छ।

प्रवर्धन को समयमा पोलिमरेज गतिविधि को अवरोध

सामान्यतया, निषेधलाई कन्टेनर अवधारणाको रूपमा प्रयोग गरिन्छ सबै कारकहरू वर्णन गर्न जसले suboptimal PCR परिणामहरू निम्त्याउँछ। एक सख्त बायोकेमिकल अर्थमा, अवरोध इन्जाइमको गतिविधिमा सीमित छ, अर्थात्, यसले DNA पोलिमरेज वा यसको कोफ्याक्टरको सक्रिय साइट (उदाहरण, Taq DNA पोलिमरेजको लागि Mg2+) सँग अन्तरक्रिया मार्फत सब्सट्रेट-उत्पादन रूपान्तरणलाई घटाउँछ वा रोक्छ।
नमूनामा भएका कम्पोनेन्टहरू वा विभिन्न बफरहरू र अभिकर्मकहरू भएका अर्कहरूले इन्जाइमलाई सीधै रोक्छ वा यसको कोफ्याक्टरहरू (जस्तै EDTA) फसाउन सक्छ, जसले पोलिमरेजलाई निष्क्रिय पार्छ र फलस्वरूप घट्दो वा गलत नकारात्मक PCR परिणामहरू निम्त्याउँछ।
यद्यपि, प्रतिक्रिया कम्पोनेन्टहरू र लक्ष्य-युक्त न्यूक्लिक एसिडहरू बीचको धेरै अन्तरक्रियाहरूलाई पनि 'PCR अवरोधकहरू' को रूपमा नामित गरिएको छ। एकपटक सेलको अखण्डता अलगावद्वारा बाधित हुन्छ र न्यूक्लिक एसिड रिलिज हुन्छ, नमूना र यसको वरपरको समाधान र ठोस चरण बीचको अन्तरक्रिया हुन सक्छ। उदाहरणका लागि, 'स्क्याभेन्जरहरू'ले गैर-सहयोगी अन्तरक्रियाहरू मार्फत एकल- वा डबल-स्ट्र्यान्डेड DNA बाँध्न सक्छन् र अन्ततः PCR प्रतिक्रिया पोतमा पुग्ने लक्ष्यहरूको संख्या घटाएर अलगाव र शुद्धीकरणमा हस्तक्षेप गर्न सक्छन्।
सामान्यतया, PCR अवरोधकहरू क्लिनिकल डायग्नोस्टिक परीक्षणहरू (पिसाबमा यूरिया, हेमोग्लोबिन र रगतमा हेपरिन), आहार पूरकहरू (जैविक अवयवहरू, ग्लाइकोजेन, फ्याट, Ca2+ आयनहरू) र वातावरणमा भएका घटकहरू (फिनोलहरू) को लागि प्रयोग गरिने अधिकांश शरीरको तरल पदार्थ र अभिकर्मकहरूमा उपस्थित हुन्छन्। भारी धातुहरू)

अधिक प्रचलित पीसीआर अवरोधकहरू ब्याक्टेरिया र युकेरियोटिक कोशिकाहरू, गैर-लक्ष्य डीएनए, टिस्यु म्याट्रिक्सका डीएनए-बाइन्डिङ म्याक्रोमोलिक्युलहरू र प्रयोगशाला उपकरणहरू जस्तै पन्जा र प्लास्टिकहरूमा फेला पार्न सकिन्छ। निकासीको समयमा वा पछि न्यूक्लिक एसिडको शुद्धीकरण PCR अवरोधहरू हटाउनको लागि रुचाइएको विधि हो।
आज, विभिन्न स्वचालित निकासी उपकरणहरूले धेरै म्यानुअल प्रोटोकलहरू प्रतिस्थापन गर्न सक्छन्, तर 100% रिकभरी र/वा लक्ष्यहरूको शुद्धीकरण कहिल्यै हासिल भएको छैन। सम्भावित अवरोधकहरू अझै पनि शुद्ध न्यूक्लिक एसिडहरूमा उपस्थित हुन सक्छन् वा पहिले नै प्रभाव पारेको हुन सक्छ। अवरोधकहरूको प्रभावलाई कम गर्न विभिन्न रणनीतिहरू अवस्थित छन्। उपयुक्त पोलिमरेजको छनोटले अवरोध गर्ने गतिविधिमा महत्त्वपूर्ण प्रभाव पार्न सक्छ। PCR अवरोध कम गर्न अन्य प्रमाणित विधिहरू पोलिमरेज एकाग्रता बढाउन वा BSA जस्ता additives लागू गर्दै छन्।
पीसीआर प्रतिक्रियाहरूको अवरोधलाई आन्तरिक प्रक्रिया गुणस्तर नियन्त्रण (IPC) को प्रयोगद्वारा प्रदर्शन गर्न सकिन्छ।
एक्स्ट्र्यासन किटमा रहेका सबै अभिकर्मकहरू र अन्य समाधानहरू, जस्तै इथेनॉल, EDTA, CETAB, LiCl, GuSCN, SDS, isopropanol र phenol लाई राम्रोसँग धुने चरणद्वारा न्यूक्लिक एसिड अलग्गै हटाउन सावधानी अपनाउनुपर्छ। तिनीहरूको एकाग्रताको आधारमा, तिनीहरूले PCR सक्रिय वा अवरोध गर्न सक्छन्।